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En 1825, el primer presidente de la República, don Guadalupe Victoria, creó oficialmente el Museo Nacional Mexicano; este recinto recuperó lo que quedaba de aquel Gabinete de 1790 y aumentó la colección, hasta que el imperio de Maximiliano cerró por decreto la Universidad.
En 1865 Maximiliano dirige una nota a su ministro de Instrucción Pública y Cultos en donde expresa su deseo que se establezca en Palacio Nacional un "Museo Público de Historia Natural, Arqueología e Historia” y que concentre en este edificio "todo lo que de interesante para las ciencias existe en nuestro país". Esta y otras medidas, obedecen a un interés, heredado de la tradición ilustrada europea, por los estudios de la flora y la fauna.
El Museo Público de Maximiliano se inauguró en julio de 1866 y con ello las colecciones del Museo Nacional cambiaron de sede después de cuarenta años de accidentada existencia en las instalaciones de la Universidad. La aventura imperial de Maximiliano de Habsburgo concluye con su fusilamiento y la de sus aliados mexicanos Miramón y Mejía en junio de 1867.

Con el regreso de Juárez resurgió el Museo Nacional, el cual incrementó su acervo y se erigió como sede de la Sociedad Mexicana de Historia Natural, cuyos miembros participaban en exploraciones para enriquecer las colecciones.
Durante el gobierno de Porfirio Díaz el Museo Nacional se dividió en tres departamentos: historia, arqueología e historia nacional. Para 1909 se decidió transformar al Museo Nacional en Museo Nacional de Arqueología, Historia y Etnografía, que mantuvo la misma sede.